Из клеток человеческой кожи получили функционирующие яйцеклетки. К клиническому применению экспериментальная технология пока не готова

Американским и корейским ученым удалось получить человеческие яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом путем переноса ядра соматической клетки кожи в донорскую яйцеклетку без ядра и манипуляций с делением получившейся клетки. Оплодотворение таких яйцеклеток сперматозоидами приводило к образованию эмбрионов, развитие которых прервали на стадии бластоцисты. Результаты проведенного исследования опубликованы в журнале Nature Communications.

Искусственное получение половых клеток (гамет) из соматических — гаметогенез in vitro — могло бы позволить людям, у которых по какой-либо причине здоровые половые клетки не вырабатываются, заводить генетически родных детей. На пути к решению этой задачи стоит несколько фундаментальных задач, первая из которых связана с тем, что гаметы, в отличие от соматических клеток, имеют не диплоидный (двойной), а гаплоидный (одинарный) набор хромосом, поэтому просто вырастить их из индуцированных стволовых клеток с диплоидным набором нельзя. Яйцеклеткам необходимы материнские цитоплазматические факторы, чтобы приобрести тотипотентность после оплодотворения, кроме того они должны правильно пройти мейотический кроссинговер, уменьшение плоидности хромосом и эпигенетическое перепрограммирование импринтинга. При этом процесс полного созревания, занимающий в организме женщины более десяти лет, для клинического применения должен быть значительно ускорен.

Альтернативой выращивания из индуцированных стволовых клеток служит перенос ядер соматических клеток, при котором в донорскую яйцеклетку с удаленным ядром помещают ядро соматической клетки искомого организма. Этот метод используют для клонирования животных и получения терапевтических эмбриональных стволовых клеток. Он не подразумевает оплодотворения, а полученный эмбрион практически идентичен генетически родительскому организму. Научная группа под руководством Шухрата Миталипова (Shoukhrat Mitalipov) из Орегонского университета здоровья и науки ранее показала, что после переноса ядра нереплицирующейся соматической клетки, остановленной на фазе G0/G1 клеточного цикла, в яйцеклетку с удаленным в фазе MII ядром образуется преждевременное веретено деления с хромосомами из одной хроматиды. При оплодотворении сперматозоидом такая яйцеклетка способна утилизировать один набор родительских хромосом в структуру, аналогичную полярному тельцу мейоза, и стать зиготой с гаплоидными пронуклеусами соматической клетки и сперматозоида, которая может развиться в диплоидный эмбрион с генетическим материалом обоих родителей. Этот подход, названный митомейозом, в экспериментах на мышах приводил к беременности и рождению потомства.

В новом исследовании Миталипов с коллегами перешел к экспериментам с человеческими клетками. У зрелых яйцеклеток, взятых у здоровых женщин, остановленных в фазе MII и содержащих полярное тельце первого деления, удалили комплексы веретен с хромосомами и перенесли в них остановленные на фазе G0/G1 ядра фибробластов человеческой кожи. После этого в них происходило преждевременное наступление метафазы без предварительной фазы S с формированием веретена деления de novo примерно через два часа после переноса. Эти клетки оплодотворили сперматозоидами методом ИКСИ, после чего 23,4 процента из них выделили полярное тельце и 17,4 процента сформировали пронуклеусы (против 82,9 и 79,8 процента у контрольных оплодотворенных яйцеклеток). Лишь 25 процентов от этого числа начали дробиться (против 100 процентов контрольных), однако процесс останавливался на стадии двух клеток, то есть окончательного выхода из фазы MII не последовало.

Чтобы решить эту проблему, исследователи разработали метод искусственной активации яйцеклеток, который состоит в их электропорации в D-сорбитовом буфере с ионами кальция (симулирующей повышение внутриклеточного уровня кальция после естественного оплодотворения) с последующим ингибированием митоз-стимулирующего фактора (MPF) росковитином. После этой процедуры 8,8 процента яйцеклеток с перенесенными ядрами развивались в бластоцисты.

Для анализа разделения хромосом в процессе митомейоза авторы работы полностью секвенировали геномы семьи из родителей разного этнического происхождения и их дочери, а также члена исследовательского коллектива, который стал донором спермы. Ядра фибробластов кожи дочери использовали для переноса в донорские яйцеклетки и оплодотворили их, запустив митомейоз. Геномный анализ полученных клеток, в которых разделились пронуклеусы и полярные тельца, показал, что у 45,6 процента из них разделения хромосом соматических ядер не произошло (все они остались либо в пронуклеусе, либо в полярном тельце), у 8,9 процента произошло неравномерно, примерно у половины оставшихся удалось получить парные последовательные последовательности геномов пронуклеуса и полярного тельца. В них число соматических хромосом оказалось близко к нормальным 23. Таким образом, митомейоз обеспечивает уменьшение числа хромосом, как и мейоз, но отличается от него случайной сегрегацией хромосом и отсутствием рекомбинации.

Секвенирование геномов полученных в результате митомейоза эмбрионов на стадии 2–6 клеток показало, что у небольшого их числа хромосомы соматических клеток и сперматозоидов интегрируются в диплоидный геном, в то время как в остальных они сегрегируются в разные сестринские бластомеры и формируют мозаичный эмбрион. В формировании практически всех эмбрионов участвовали все 23 гомолога хромосом сперматозоидов, но число гомологов соматических клеток оказалось непостоянным, и эмбрионы получались анеуплоидными (с числом хромосом, не кратным гаплоидному набору).

Полученные результаты служат подтверждением концепции того. Что у митомейоза есть потенциал для осуществления гаметогенеза in vitro, однако для клинического применения методика нуждается в дальнейшем совершенствовании, чтобы повысить ее эффективность и безопасность, обеспечить постоянство результатов и лучшее качество получаемых эмбрионов.

Сперматозоиды устроены значительно проще яйцеклеток, и эксперименты с их искусственным получением продвинулись дальше. Исследователям уже удавалось вырастить из стволовых клеток функциональные сперматозоиды мышей (об этом материал «Внуки стволовой клетки») и крыс и использовать их для зачатия жизнеспособного и фертильного потомства. О том, какие перспективы открывает искусственное получение половых клеток, можно почитать в блоге «Мама из пробирки: как искусственные фолликулы и яйцеклетки помогут носорогам и нам».

Источник